NAD-蘋果酸酶（NAD-ME）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法
貨號(hào): BC1135
規(guī)格: 100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入10 mL提取液充分溶解備用；

2. 試劑三：臨用前每支加1 mL雙蒸水充分溶解備用；

3. 試劑四：用時(shí)每支加500 μL雙蒸水充分溶解備用；

4. 工作液：在7.5 mL試劑二中加入1 mL試劑三和0.5 mL試劑四，可以根據(jù)比例現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：
ME廣泛存在于微生物、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物和植物胞漿中，尤其在植物組織中活性較高。ME催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應(yīng)，產(chǎn)生丙 酮酸和CO₂，以及伴隨NAD(P)⁺的還原反應(yīng)，是蘋果酸代謝的關(guān)鍵酶。ME活性與生物合成和抗氧化密切相關(guān)。近年來(lái)植物ME活性測(cè)定較多，已經(jīng)成為抗氧化研究的熱點(diǎn)。根據(jù)輔酶專一性和對(duì)底物特異性的不同，可將ME分為NAD-ME(EC1.1.1.38)和NADP-ME(EC1.1.1.40)。
NAD-ME催化NAD⁺還原成NADH，在340nm下測(cè)定NADH增加速率。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見(jiàn)“產(chǎn)品資料"附件
注意事項(xiàng)：

1. 若A2-A1大于0.5，需將樣本用提取液稀釋，使A2-A1小于0.5，可提高檢測(cè)靈敏度。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃或25℃水浴放置。

3. 比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過(guò)程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。用96孔板做時(shí)盡量保持反應(yīng)溫度在37℃或25℃。

4. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。用96孔板做時(shí)盡量做到樣本反應(yīng)時(shí)間一致。

5. 如果ΔA＜0.01，可將反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)到10分鐘。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g肝加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清，按照測(cè)定步驟操作，使用微量石英比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA=A2-A1=0.893-0.6814=0.2116，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

NAD-ME（U/g 質(zhì)量）=965×ΔA÷W=965×0.2116÷0.1=2041.94 U/g 質(zhì)量。
參考文獻(xiàn)：

1. Spampinato C P, Colombo S L, Andreo C S. Interaction of analogues of substrate with NADP-malic enzyme from maize leaves[J]. Photosynthesis research, 1994, 39(1): 67-73.

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